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Gezielte gentechnische Veränderung von Bakterien durch Transformation ist eine beliebte Methode, um die Funktion von Genen zu untersuchen oder Fremdeiweiße (rekombinante Proteine) in Bakterien herzustellen. In der Schule ist Transformation aus verschiedenen Gründen schwierig zu bewerkstelligen. Die meisten Verfahren benötigen teure Geräte (z.B. für die Elektroporation) oder es müssen erst aufwändig kompetente Zellen hergestellt oder teuer eingekauft werden.

Die Auflagen des Gentechnikgesetzes müssen stets berücksichtigt werden. Eine allgemeine Stellungnahme zur Verwendung des BlueGenes Experimentierkastens und zum Begriff der Selbstklonierung ist auf den Internetseiten der Zentralen Kommission für die biologische Sicherheit (ZKBS) in der Rubrik „Allgemeine Themen“ unter folgender Adresse zu finden:
http://www.bvl.bund.de/nn_495478/DE/06__Gentechnik/093__ZKBS/zkbs__node.html__nnn=true

Eine gängige und für Schülerlabore geeignete Methode ist die TSS-Methode (Transformation & Storage Solution).
2x TSS ist LB, das 20% PEG-6000,10% DMSO und 100 mM MgSO4 enthält. Dazu 1 g NaCl, 1 g Hefeextrakt, 2 g Pepton aus Casein in etwa 100 ml Wasser lösen, 40 g PEG-6000 und 2,4 g Magnesiumsulfat zugeben und auch 180ml auffüllen. Nach Zugabe von 20ml DMSO autoklavieren und im Kühlschrank aufbewahren.
Durchführung:
- Entnehme zweimal 50 μl einer stationären Übernacht- E.coli -Kultur in LB, pipettiere in zwei Mikrozentrifugenröhrchen und stelle die Röhrchen in einen Eiskübel.
- Mische die Zellen mit jeweils 50 μl eiskaltem 2xTSS und vermische heftig mit einem Schüttler und stelle die Röhrchen zurück auf Eis, die Zellen sind jetzt kompetent
- Gebe zu einem Röhrchen 0,1μg Plasmid DNA (2 μl eines Plasmid-Miniprep) hinzu, gebe zum anderen Röhrchen das gleiche Volumen an Wasser (Kontrolle) und mische durch kurzes Schütteln und lasse die Röhrchen für 20 min auf Eis stehen.
- Plattiere die Zellen auf LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum aus.

Transformation Ca-kompetenter Zellen durch Hitzeschock:
TB-Lösung (10mM PIPES, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl) muss frisch hergestellt werden und
sollte gut auf Eis gekühlt sein!
Durchführung:
- Sie erhalten eine Kultur von E.coli Zellen in LB Medium. Die Zellen wurden bereits mehrere Stunden bei 37° C geschüttelt und befinden sich in der logarithmischen Wachstumsphase.
- Überführe Sie 50ml Kultur in ein Zentrifugenröhrchen kühle die Zellen auf Eis (mindestens 5 Minuten) zentrifugiere 10 min. bei 4500g.
- Löse das Pellet in 35 ml TB-Lösung (eiskalt!) und lagere die Probe 5 Minuten auf Eis. Zentrifugiere 10 min bei 4500g.
- Löse das Pellet in 5 ml TB-Lösung (eiskalt!). Füge langsam tropfenweise 350μl DMSO Lösung hinzu und lagere die Zellen 10 Minuten auf Eis.
- Pipettiere in zwei Mikrozentrifugenröhrchen je 50μl Zellen und stelle die Röhrchen in einen Eiskübel. Gebe zu einem Röhrchen 0,1μg Plasmid DNA (2 μl eines Plasmid-Miniprep) hinzu, gebe zum anderen Röhrchen das gleiche Volumen an Wasser (Kontrolle), mische durch kurzes Schütteln und lasse die Röhrchen für 2 min auf Eis stehen.
- Führe den Hitzeschock 1 min bei 37° C im Wasserbad durch, danach die Zellen gleich wieder für mindestens 2 min. auf Eis lagern und anschließend auf Selektionsplatten ausplattieren.

Transformation Kit (Fermentas)
- Pipettiere 100 μl einer E. coli ÜN-Kultur zu 1ml vorgewärmten T-AID C-Medium. Inkubiere im Inkubationsschüttler für mindestens 30-45 Min. bei 37° C (In dieser Zeit kommen die Bakterien in die logarithmische Wachstumsphase).
- Stellen Sie Ihre Selektionsplatten in den Brutschrank zum vorwärmen und mischen Sie auf Eis in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß: 150 μl der T-Solution (A) aus dem Kit mit 150 μl der T-Solution (B). Es ist absolut notwendig, dass alle Lösungen und Reaktionsgefäße ab jetzt auf Eis gekühlt werden!
- Zentrifugiere die E. coli Kultur in C-Medium für 1 Min. bei 10 000 rpm. Verwerfe den Überstand und resuspendiere das Pellet in 200 μl der kalten T-Solution-Mix-Lösung durch Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie 5 Min. auf Eis.
- Zentrifugiere erneut für 1 min. und verwerfe den Überstand. Resuspendiere die Zellen nun in 100 μl kalter T-Solution-Mix und inkubiere erneut 5 min. auf Eis.
- Pipettiere in zwei Mikrozentrifugenröhrchen je 50μl Zellen und stelle die Röhrchen in einen Eiskübel. Gebe zu einem Röhrchen 0,1μg Plasmid DNA (2 μl eines Plasmid-Miniprep) hinzu, gebe zum anderen Röhrchen das gleiche Volumen an Wasser (Kontrolle), mische durch kurzes Schütteln und lasse die Röhrchen für 5 min. auf Eis stehen.
- Plattiere 25μl der Lösung auf den vorgewärmten Selektionsplatten aus.